Th22、Th1细胞在乙肝肝衰竭中表达及其意义 Th22、Th1细胞在乙肝肝衰竭中表达及其意义
张沛枫*，赵 云
（南通市第三人民医院感染科，江苏226006）
[摘 要] 目的：通过检测乙肝相关性肝衰竭（HBV-LF）患者外周血Th22、Th1细胞频数，探讨Th22、Th1细胞与HBV-LF发生的相互关系以及对HBV-LF的预测价值。方法：随机选择43例HBV-LF、29例慢性乙型肝炎（CHB）患者作为研究对象，同时选择20例健康者作为对照组，釆用流式细胞术检测外周血Th22、Th1细胞频数，分析Th22、Th1细胞与HBV-LF患者肝功能等指标的相关性，以及对HBV-LF发生及转归的预测价值。结果：乙肝相关性慢加亚急性肝衰竭（HBV-ACLF）外周血Th22、Th1、Th22/Th1分别为（7.86±3.21）%、（8.84±3.05）%、0.91±0.27，乙肝相关性慢性肝衰竭（HBV-CLF）外周血Th22、Th1、Th22/Th1分别为（8.68±2.87）%、（9.46±2.99）%、0.98±0.39，慢性肝炎组分别为（5.42±1.76）%、（5.46±1.95）%、1.07±0.54，对照组分别为（2.33±1.98）%、（3.36±1.28）%、0.75±0.37，HBV-LF、CHB患者外周血Th22、Th1细胞频数高于健康对照组，HBV-LF患者高于CHB患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；HBV-LF、CHB患者Th22、Th1细胞频数与总胆红素（TBIL）（R/RS=0.381、P=0.0020，R/RS=0.341、P=0.005）、凝血酶原时间（PT）（R/RS=0.507、P=0.000，R/RS=0.597、P=0.000）、国际标准化比值（INR）（R/RS=0.35、P=0.006，R/RS=0.35、P=0.006）、MELD（R/RS=0.327、P=0.007，R/RS=0.46、P=0.000）呈正相关，与白蛋白（ALB）（R/RS=0.310、P=0.003，R/RS=0.494、P= 0.000）、胆碱酯酶（CHE）（R/RS=0.257、P=0.026，R/RS=0.247、P=0.032）呈负相关（P＜0.05）；Th22、Th1细胞预测HBV-LF发生的受试工作者曲线下面积（AUC）分别为0.797、0.839（均P＜0.05），最佳临界值分别为6.49%、5.87%。结论：Th22与Th1细胞频数能够反映乙肝相关性肝病的严重程度，对HBV-LF发生有预测作用。
[关键词] 肝衰竭；Th1细胞；Th22细胞；乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒可以引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及肝癌等，是导致终末期肝病的主要原因，严重威胁人类健康[1-3]。迄今为止乙肝相关性肝衰竭死亡率一直居高不下，及早预测肝衰竭发生并及时干预治疗对改善患者预后极为重要。Thl细胞是一类重要的免疫细胞，以分泌IFN-γ为特征，在肿瘤免疫方面的作用较为明确，有研究报道Th1细胞在肝衰竭患者中表达水平明显升高[4]。Th22在自身免疫性疾病、肿瘤以及感染性疾病等多种疾病的发生发展中发挥重要作用，对于其在慢性乙型肝炎中的作用已经有一定了解。本研究选择3月—2月我院住院的乙肝相关性肝衰竭（HBV-LF）、慢性乙型肝炎（CHB）患者共72例为研究对象，检测外周血中Th1、Th22细胞数量，分析其相互关系及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 72例患者中男性40例，女性32例，年龄32～56岁。其中HBV-LF组43例，包括HBV-ACLF18例（早期4例，中期10例，晚期4例）和HBV-CLF25例，CHB组患者29例（轻度15例，中度12例，重度2例）。同时选择体检健康人群20例作为对照组，其中男性12例，女性8例，年龄32～44岁。
1.2 方法
1.2.1 外周血Th1、Th22细胞检测：取100μL全血放入流式管中，加入2μL刺激剂（PMA、离子霉素、BFA）充分混匀，37℃、5%CO2培养箱孵育4～6小时，鞘液水洗1次，加入鼠抗人CD4+-PC5抗体10μL，避光静置20min，鞘液水再洗1次，加入破膜剂A固定，避光15 min，鞘液水洗1次，加入破膜剂B破膜、破红，加入抗人IL-22-PE、鼠抗人IFNγ-PE、抗人IL-17-FITC，室温避光15 min，鞘液水洗1次，用PBS重悬细胞，离心1 500r/min，5min，去除上清，PBS缓冲液重悬细胞，2小时内上机检测。实验象限确定依据用于实验的相应荧光对照，资料采用MXP软件分析。IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+T细胞为Th22细胞，CD4+IFN-γ+为Th1细胞。
1.2.2 血生化和HBV标志物检测：清晨在患者空腹时采集血约4mL置入肝素钠抗凝管，测定外周血Th22、Th1细胞。同步留取血液标本测定ALT、AST、TBIL、ALB、CHE、Cr、PT、INR、HBsAg、HBeAg、HBVDNA等。
1.3 MELD（model for end-stage liver disease，终末期肝病模型）分值计算方法 MELD=3.8ln[胆红素（mg/dL）]+11.2ln（INR）+9.6ln[肌酐（mg/dL）]+6.4（病因：胆汁性或酒精性为0，其他为1）。
1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量数据以均数±标准差（
s）表示，两组均数比较使用t检验或者u检验，多组均数比较使用方差分析，组间比较使用LSD-L法，变量间的相关性采用Pearson直线相关分析；偏态分布资料以中位数（四分位数间距）M（iqr）表示，变量间的相关性采用Spearman秩和相关分析。采用Med-Cal统计软件绘制ROC曲线，确定最佳临界值，以及相关指标的准确性、灵敏度、特异性。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 HBV-LF组与CHB组生化指标以及HBVDNA、MELD比较 HBV-LF组ALT、TBIL、ALB、PT、INR、MELD、HBV-DNA与CHB组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
2.2 HBV-LF患者Th22、Th1细胞与肝功能等指标相关性分析 HBV-LF患者Th22、Th1细胞频数与TBIL、PT、INR、MELD呈正相关，与ALB、CHE呈负相关（P＜0.05），与 AST、ALT、HBeAg、HBsAg及HBV-DNA无相关性（P＞0.05）。见表2。
表1 HBV-LF组与CHB组患者生化指标、MELD以及HBVDNA比较
*偏态分布资料以中位数（四分位数间距）M（iqr）表示
生化指标 HBV-LF（n=43）CHB（n=29） F值/Z值 P值ALT（U/L)*85（102） 163（264） 8.68 0.000 AST（U/L）*102（153） 94（172） 0.78 0.467 TBIL（μmol/L）*143（267） 11.4（9.53） 79.87 0.000 ALB（g/L） 26.78±18.32 44.34±8.29 7.31 0.000 PT（s） 29.62±6.97 11.17±0.97 8.43 0.000 INR*2.08（1.95） 1（1.23） 49.76 0.000 MELD 25.72±4.76 7.45±1.97 169.08 0.000 HBV-DNA（lg copies/mL） 3.87±1.60 6.72±1.22 7.36 0.004
表2 HBV-LF患者TH22、Th1细胞与相关指标的相关性
指标 Th22 Th1 R/RS值 P值 R/RS值 P值ALT -0.056 0.424 -0.010 0.934 AST -0.035 0.615 -0.055 0.675 TBIL 0.381 0.002 0.341 0.005 ALB -0.310 0.003 -0.494 0.000 CHE -0.257 0.026 -0.247 0.032 PT 0.507 0.000 0.597 0.000 INR 0.35 0.006 0.35 0.006 MELD 0.327 0.007 0.460 0.000 HBeAg 0.012 0.874 -0.014 0.943 HBsAg 0.009 0.901 -0.122 0.189 HBV-DNA -0.092 0.435 -0.292 0.175
2.3 HBV-LF组Th22、Th1及Th22/Th1与CHB组、健康组比较 HBV-LF、CHB患者外周血Th22、Th1频数均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HBV-LF患者高于CHB患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。HBV-LF、CHB患者外周血Th1与Th22细胞呈正相关（r=0.674，P=0.000）。见表3、图1。
表3 各组Th22、Th1细胞频数比较
与健康组比较，*P＜0.05；与慢乙肝组比较，△P＜0.05
组别 例数 Th22 Th1 Th22/Th1 ACLF 18 7.86±3.21*△8.84±3.05*△0.91±0.27 CLF 25 8.68±2.87*△9.46±2.99*△0.98±0.39 CHB 29 5.42±1.76*5.46±1.95*1.07±0.54健康组 20 2.33±1.98 3.36±1.28 0.75±0.37 F值 9.20 8.90 2.19 P值 0.000 0.000 0.094
图1 Th1细胞与Th22细胞相关性
2.4 外周血Th22、Th1细胞预测LF发生的ROC曲线分析 Th22、Th1细胞预测HBV-LF发生的受试工作者曲线下面积（AUC）分别为0.797、0.839（均P= 0.000），最佳临界值分别为6.49%及5.87%。见图2、表4。
图2 Th1、Th22细胞预测LF发生的ROC曲线
表4 Th22、Th1细胞预测LF发生的ROC曲线分析
最佳临界值 敏感性（%）特异性（%） AUC P Th22 6.49% 74.4 71.7 0.797（0.702～0.872）0.000 Th1 5.87% 90.7 69.8 0.839（0.749～0.906）0.000
3 讨 论
Th22细胞是Trifari等[5]于发现的一种新型Th细胞，以高分泌IL-22为标志，主要通过分泌IL-22与表达IL-22受体的组织细胞结合而发挥作用[6]。前期研究发现，慢性乙型肝炎患者肝组织内的IL-22与肝脏纤维化分期负相关[7]，提示IL-22可能在CHB的炎性损伤和纤维化过程中发挥保护性作用。最近研究结果显示，在HBV相关肝病患者中，随着病情的加重，Th22频数却明显升高，而在CHB组中肝损伤较重的患者，Th22频数低于肝损伤较轻者。推测Th22可能在一定阈值内起保护作用，超过一定阈值可能起相反作用。也有学者认为，Th22及其IL-22是起保护性还是损伤性作用，取决于受影响组织的本质和局部细胞因子的环境[8]。Radaeva等[9]运用刀豆蛋白A诱导的肝炎模型，发现IL-22预处理可减轻刀豆蛋白A的效应，而同时注射刀豆蛋白A和IL-22中和抗体，则增强刀豆蛋白A的效应，因此认为IL-22是肝细胞的存活因子，在肝损伤中具有保护作用。本研究结果显示，HBV相关肝病患者外周血Th22细胞明显高于对照组，提示Th22细胞可能参与肝脏炎症，在疾病发展过程中起一定作用。
Th1细胞主要增强CD8+T细胞活性，促进细胞免疫反应，清除细胞内病毒，加重肝细胞损伤。研究表明，由于Th1分泌IFN－γ，对HBV有一定杀伤作用，在HBV感染细胞后，Th1细胞表达水平明显升高，在急性肝衰竭中升高更明显，提示Th1细胞参与肝脏炎症发生、发展过程，可反映细胞免疫和炎症反应的强度[10-12]。本研究中HBV相关肝病患者外周血Th1细胞也明显高于对照组，提示Th1细胞可反映疾病的严重程度。Th22与Th1细胞呈正相关，提示在HBV相关性肝病中Th22与Th1细胞在疾病发生过程中可能起着协同作用，共同促进炎性发生，造成组织损伤。本研究对Th22、Th1细胞预测肝衰竭发生进行ROC曲线绘制，结果显示Th22、Th1细胞均有预测作用，AUC分别为0.797、0.839，临界值分别为6.49%，5.87%，临界预测值的特异性、敏感性均较高，但二者对HBV引起肝衰竭预测准确性无明显差异。这些结果提示Th22、Th1细胞可作为HBV引起肝衰竭的潜在预测指标。
免疫反应造成的损伤在肝衰竭的发生中起至关重要的作用。肝细胞受到严重损伤后，损伤的肝细胞释放相关炎性介质可再度引发坏死和凋亡[1]。肝衰竭时，肝组织坏死等，造成微血管栓塞、肝血窦结构破坏，引起明显的肝灌流障碍，造成缺血缺氧、再灌注损伤及内毒素血症三重打击，最后存活的肝细胞不能维持人体正常物质代谢功能。凝血、白蛋白所需的各种酶均在肝脏合成，ALB及PT可间接反映肝脏的合成功能。
目前对于Th22、Th1细胞在肝脏疾病中的研究尚处在初始阶段，肝衰竭发生时患者体内的Th22与Th1细胞的关系还未完全阐明，它们在肝脏疾病中的作用机制也未明确，值得进一步深入研究。
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Significance of Th22,Th1 cells in hepatitis B liver failure
ZHANG Peifeng,ZHAO Yun
(Department of Infectious Diseases,the third People’s Hospital of Nantong,Jiangsu 226006)
[Abstract] Objective:To investigate the correlation of Th22 and Th1 cells with the occurrence of HBV-related liver failure（HBV-LF）and their predictive values on the occurrence of HBV-LF through detecting the frequencies of Th22 and Th1 cells in peripheral bloods of patients with HBV-LF.Methods:43 patients with HBV-LF,29 patients with chronic hepatitis B（CHB）were randomly selected as the study subjects,at the same time,20 healthy people were taken as the control group.The flow cytometry was used to detect the frequencies of Th22 and Th1 cells in peripheral bloods of patients in different groups,and the comparisons among different groups were conducted.The correlations of Th22 and Th1 cells in peripheral blood with indicators such as liver function and model for end-stage liver disease(MELD)in patients with HBVLF and their predictive values on the occurrence and outcome of HBV-LF were analyzed.Results:Peripheral T h22,Thl and Th22/T h1 w ere(7.86±3.21)%、(8.84±3.05)%and 0.91±0.27 in HBV-related acute-on-chronic liver failure(HBVACLF)group，(8.68±2.87)%、(9.46±2.99)%and 0.98±0.39 in HBV-related chronic liver failure(HBV-CLF)group,(5.42± 1.76)%、(5.46±1.95)%and 1.07±0.54 in CHB group，and(2.33±1.98)%、(3.36±1.28)%、0.75±0.37 in healthy control group. The frequencies of Th22 and Th1 cells in peripheral bloods of patients with HBV-LF and CHB were significantly higher than those in the healthy control group.The frequencies of Th22 and Th1 cells in peripheral bloods of patients with HBVLF were significantly higher than those in patients with CHB (all P＜0.05).The frequencies of Th22 cells and Th1 cells in patients with HBV-LF and CHB were positively correlated with total bilirubin （TBIL）(R/RS=0.381、P=0.0020，R/RS= 0.341、P=0.005),prothrombin time（PT）(R/RS=0.507、P=0.000，R/RS=0.597、P=0.000),international normalized ratio（INR）(R/RS=0.35、P=0.006，R/RS=0.35、P=0.006)、MELD(R/RS=0.327、P=0.007，R/RS=0.46、P=0.000),were negatively correlated with albumin（ALB）(R/RS=0.310、P=0.003，R/RS=0.494、P=0.000)and cholinesterase（CHE）(R/RS=0.257、P=0.026，R/RS=0.247、P=0.032)(P＜0.05).The AUCs of Th22 and Th1 cells for the prediction of the occurrence of HBV-LF were 0.797 and 0.839 respectively（both P＜0.05），the best critical value were 6.49%and 5.87%respectively.Conclusions:Th22 and Th1 cells can reflect the severity of the disease.The frequencies of Th22 and Th1 cells have a predictive value on the occurrence of HBV-LF.
[Key words] Liver failure;Th1 cells;Th22 cells;Hepatitis B virus
[中图分类号] R575.3
[文献标志码]A
[收稿日期] -12-30
［文章编号］1006-2440（）01-0013-04*[作者简介]张沛枫，女，汉族，江苏南通人，生于1981年9月，硕士，主治医师。研究方向：传染病诊治。
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