人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒

人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒

【生产厂家】中山大学达安基因股份有限公司

【批准文号】国药准字S0056

【剂 型】检测试剂盒

【规 格】1人份

【医保类型】

【国家基本药物】否

【英文名】Human cytomegalovirus Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Diagnostic Kit

【汉语拼音】ren ju xi bao bing du he suan kuo zeng ying guang ding liang jian ce shi ji he

【正文】

【用途】

本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者人巨细胞病毒（HCMV）感染的辅助诊断和疗效监控，不用于血源筛查。本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。对实验结果的解释，详见【实验结果的解释】及【本检测方法的局限性】。

【原理和用途简介】

本品选取人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp，利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。

【试剂盒组成】

DNA提取液（500μl/管） 2管

HCMV-PCR反应管（未贴标签管） 20管

阳性定量参考品（2×108copies/ml）（50μl/管） 1管

弱阳性质控品（200μl/管）1管

强阳性质控品（200μl/管）1管

阴性质控品（50μl/管） 1管

稀释液（500μl/管）1管

【标本采集、保存和运送】

【标本采集和保存】

尿或乳汁：

取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。

血清：

用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml Eppendoff管，4℃静置过夜。吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。标本可立即用于测试（48小时以内），也可以保存于-20℃待测保存期为6个月

淋巴细胞：

取静脉血（EDTA抗凝）1ml，利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。

【标本运送】

标本运送应采用0℃冰壶。

【适用仪器】

PE GeneAmp 5700，ABI PRISM 7000，ABI PRISM 7700

【使用方法】

1. 标本处理

1.1 尿液或乳汁 标本12,000rpm离心5分钟,沉淀加50μl DNA提取液打匀。（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截）100℃保温10分钟（误差不超过1分钟）。（为保证病毒颗粒充分裂解，可转至4℃静置8~12小时）12,000rpm离心5分钟，取上清液（含病毒DNA）5μl做PCR扩增。

1.2 血清 用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml Eppendoff管，4℃静置过夜。吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。取50μl血清加50μlDNA提取液打匀，100℃保温10分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清液（含病毒DNA）5μl做PCR扩增。

1.3淋巴细胞 加入1ml生理盐水至装有1ml静脉血（EDTA抗凝）的离心管中，沿管壁轻轻打入并轻微混匀。将此2ml混合血液沿试管壁缓缓加入到装有2ml淋巴细胞分离液的试管中，不能震荡和混匀。2500rpm，15分钟离心后，用加样枪吸出中间的细胞层于离心管中，10,000rpm离心5分钟，沉淀加50μl DNA提取液打匀。100℃保温10分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清液（含病毒DNA）5μl做PCR扩增。

1.4阴阳性质控品

质控品加50μl DNA提取液打匀。100℃保温10分钟(误差不超过1分钟)，2,000 rpm离心5分钟，取上清液5μl做PCR扩增。

2.参考品稀释和处理

将阳性定量参考品（2×108copies/ml）6,000rpm离心数秒标示为108，另取4支灭菌新0.5ml离心管，分别加入90μl稀释液，依次标示为107--104。吸取108管10μl至107管，用加样器反复混匀后换新吸头取10μl至106管，依此方法依次稀释至104管。-20℃保存；吸取5个（2×108--2×104copies/ml）的阳性定量参考品梯度和阴性质控品各40μl，分别加40μl DNA提取液打匀，以下步骤同样本处理。上清液（含病毒DNA）待用于PCR扩增。

3．PCR扩增

ABI PRISM 7000，PE GeneAmp 5700：取HCMV-PCR反应管若干，分别加入处理后上清液（含病毒DNA）各5μl，6,000rpm离心1分钟。将各反应管放入定量PCR仪器的孔样品槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量质控参考品梯度（应设置为108--104copies/ml）以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件:93℃→2分钟预变性,然后按93℃ 45秒→55℃ 60秒,先做10个循环，最后按93℃ 30秒→55℃ 45秒,做30个循环。

Roche LightCycler：将处理后的样品（或阴阳性质控参考品）2μl加入专用毛细管中，盖上PCR反应盖，8,000rpm离心2分钟，插入圆形卡盘倒置10秒钟后放入仪器中设置循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃ 5秒→57℃ 45秒，做40个循环。37℃1秒。

所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。

4．结果分析条件的设定

PE GeneAmp 5700 、ABI PRISM 7000的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（2～4），stop值（7～9）以及Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳（correlation数值介于-0.97～-1之间，correlation数值等同于r值），最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty）。

Roche LightCycler的条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值(Fluorescence)为F1/F2，点击Quantification读取结果。调节噪声容限在阴性对照以上，要求在Step3:Analysis下相关性r值<-0.97，接近-1.0。并保证阴性对照Ct值不出现任何数值。最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M）。

【质量控制】

阴性质控品：全部阴性

阳性定量参考品：全部阳性

|r|≥0.97（correlation数值等同于r值），

弱阳性质控品数值范围：2.5×104拷贝/ml～4×105拷贝/ml

强阳性质控品数值范围：2.50×106拷贝/ml～4.0×107拷贝/ml

以上要求需在同一次试验中同时满足。否则，本次试验无效，全部试验应重新进行。

【结果判定】

1.阴性结果判定：

ABI Prism 7000，PE GeneAmp 5700仪器：如果增长曲线不是典型的S曲线或Ct值=30，则实验结果判为小于104copies/ml。

Roche Light Cycler：如果增长曲线不是典型的S曲线或Ct值为空白，则实验结果判为小于104copies/ml。

2.阳性结果判定与计算：

ABI Prism 7000，PE GeneAmp 5700仪器：如果增长曲线呈典型的S曲线且Ct值＜27，则实验结果判为阳性。样品的HCMV DNA含量（copies/ml）=Qty/20。若样品为血清，则样品中的HCMV DNA含量（copies/ml）=Qty

Roche Light Cycler：如果增长曲线呈典型的S曲线且Ct值＜37，则实验结果判为阳性。样品的HCMV DNA含量（copies/ml）=M/20。若样品为血清，则样品中的HCMV DNA含量（copies/ml）=M

【实验结果的解释】

1.对于检测结果阳性的报告，只表明该样本中有病毒的遗传物质DNA存在，并不表明有活病毒存在。

2.虽然本试剂盒检测特异性、灵敏度均较高，但测定结果为阴性的并不能排除样本含有病毒，只能说明样本中含有的病毒浓度低于本试剂盒的检测灵敏度。

【产品的性能指标】

1.根据临床考核结果，本试剂盒的检出限度为104copies/ml。

2.本检测系统的交叉反应性已经临床考核的检验而确定，EB、HPV6型、HPV11型、HSV-1、HSV-2与本品无交叉反应，阳性结果可以排除疱疹病毒群中的其它属病毒。

3.根据本品对临床确诊HCMV患者连续监测的结果：人巨细胞病毒感染后为持续性或间隙性排毒，阴性结果不能排除人巨细胞病毒感染。需在不同的时间段同时取不同组织的样品以确证人巨细胞病毒DNA的存在。

【批准文号】

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